新近的研究表明，Rho激酶抑制剂可以使细胞骨架的结构重组，可以激活多种特异性转录因子[6]，同时Rho抑制剂还具有促进细胞增殖分化，抑制细胞凋亡等多种生物学效应[7]。但Rho激酶抑制剂是否能通过Ras/MAPK信号通路表达下游转录因子活性，并在Sr诱导骨髓间充质干细胞向成骨分化过程中起重要作用，目前仍尚不清楚[8]。为此，本文通过4组实验(一组对照、三组实验)在雷奈酸锶的基础上施加特异性的Rho激酶抑制剂Y-2763- 2，观察骨髓间充质干细胞的分裂增殖、分化、蛋白浓度、碱性磷酸酶活性和下游基因表达活性等因素[9]，并结合数据与图像分析来探究（1）Sr是否能通过该抑制剂促进rBMSCs向成骨细胞分化；（2）该抑制剂是否能通过阻断某种信号通路进而单独扩增rBMSCs；（3）该抑制剂是否能够促进Sr在rBMSCs向成骨细胞分化中基因的表达。

1材料与方法

1.1主要材料

1.1.1 实验动物

4周龄雄性SD大鼠购自徐州医学院实验动物中心。

1.1.2 主要试剂

低糖DEME/F12培养基、胎牛血清、胰蛋白酶购自美国Gibco公司；Sr干混悬剂购自日本Servier公司；Rho激酶抑制剂Y-27632购自美国Sigma公司；ALP检测试剂盒和BCA蛋白浓度测定试剂盒购自南京碧云天生物技术有限公司；CC K-8活性检测试剂盒购自南京恩晶生物科技有限公司；动物总RNA快速提取试剂盒（Trizol-离心柱型）购自上海捷瑞生物工程有限公司；反转录cDNA试剂、SYBR‖+ROX购自大连TAKARA公司；β—Actin、Runx-2、OST、β—CAT、OPG、OPN、OCN、COL等各种内参、上下游转录因子或基因购自美国GENEray公司。

1.1.3 主要仪器

二氧化碳孵育箱购自美国Thermo公司；倒置相差显微镜购自日本Oly- mpus公司；酶标仪购自美国BIO-TEK公司；定量PCR仪购自美国ABI公司。

1.2 主要方法

1.2.1 大鼠rBMSCs的分离纯化、原代培养及传代

取4周龄雄性SD大鼠，断颈处死后用75%乙醇浸泡一段时间，在超净工作台上取下大鼠两侧的股骨与胫骨，剔净周围少量软组织与肌肉。用10 mL注射器将含体积分数10%胎牛血清的低糖DMEM培养基反复冲洗骨髓腔，直到骨髓腔发白。利用注射器反复吹打冲洗液使细胞呈单个状态，将制成的细胞悬液接种在25 cm2培养瓶中（一般一只大鼠的一侧骨髓接种一瓶培养瓶），将其置于二氧化碳培养箱中[10]。24小时后第一次换液，以后每隔2d重新换液一次。每次换液时在倒置相差显微镜下观察其细胞形态特征与生长情况。若观察到细胞贴壁生长铺满瓶底，可用胰蛋白酶消化贴壁细胞，按照细胞量多少1：2或2:3进行传代。一般细胞传代时间间隔为5-7天。当传至P3-P5代时即可用于后续实验研究。来!自~751论-文|网www.751com.cn

1.2.2  CCK-8细胞活力与增殖的检测[11]  

  在96孔板中接种第3代rBMSCs，贴壁培养4小时后换液，A组：新鲜的完全培养基；B组：含浓度为10umol/L Y抑制剂的完全培养基[7]，C组：含浓度为10umol/LSr的完全培养基；D：含与B和C组同等浓度的Y抑制剂和Sr的完全培养基。放入37℃孵育箱培养。分别在第1、4、7天取出一个96孔板样品，吸去培养基，用PBS冲洗后每孔加入110μL CCK-8与培养基混合溶液，其中CCK-8溶液每孔需10μL ，37℃孵育2h，取出后利用酶标仪在450nm波长下测定其吸光值。以细胞培养日期为横轴，A为纵轴，绘制出细胞生长曲线。