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牛Mx1蛋白抑制猪瘟病毒增殖的初步研究 (2)

时间:2019-03-31 11:44来源:毕业论文
Mx蛋白(Myxovirus resistance)是由I型(/)和III型()干扰素(Interferon, IFN)诱导宿主细胞产生先天性免疫的关键性抗病毒蛋白之一。50年前,Jean Lindenmann与


Mx蛋白(Myxovirus resistance)是由I型(α/β)和III型(λ)干扰素(Interferon, IFN)诱导宿主细胞产生先天性免疫的关键性抗病毒蛋白之一。50年前,Jean Lindenmann与Alick Isaacs在研究IFN时发现近交系小鼠(A2G)对致命剂量的流感病毒具有天然抵抗力,这正是由16号染色体上的Mx基因控制的[7]。Mx基因几乎存在于所有脊椎动物的基因组中,从鱼到灵长类,它们主要在抑制RNA病毒中发挥作用[8]。,比如:甲型流感病毒(Influenza A Virus, IAV)、水疱性口炎病毒(Vesicular Stomatitis Virus, VSV)、索戈托病毒(Thogoto Virus, THOV)等等。近期研究表明人MxA对非洲猪瘟、乙型肝炎等DNA病毒也有抑制作用。Mx蛋白结构在脊椎动物中是高度保守的,大部分的哺乳动物有两个Mx基因,如人有Mx1(MxA)和Mx2(MxB)。不同种属的Mx基因来源于两个不同的复制子,而少部分脊椎动物丢了某一个原始的Mx基因。
Mx蛋白属于发动蛋白家族,具有很强的GTP酶活以及自装配倾向。有N端GTP酶活区(GTPase domain, GD)、中间域(Middle domain, MD)、C端酶活效应区(GTPase effector domain, GED)[14],但是缺乏PH结构域(参与膜定位)和一个富含脯氨酸的结构域(涉及到蛋白质之间的相互作用)[15]。在低蛋白浓度核磷酸盐浓度下,Mx蛋白在溶液中形成四聚物。在高蛋白浓度(1.5 mg/ml),这些四聚体低聚化形成较大的丝状和环状。
已有研究表明poMx1(porcine Mx1)可以抑制CSFV和VSV的增殖[12],另有文献报道boMx1(bovine Mx1)抑制VSV,狂犬病毒[15](Rabies Virus,RV)和口蹄疫病毒[9](Foot and Mouth Disease Virus,FMDV)的增殖,但是具体是在病毒增殖哪一步产生的抑制作用还有待研究[10]。由于BVDV和CSFV属于同种同属的病毒,并且其抗体具有交叉保护作用,所以研究boMx1抑制CSFV增殖具有一定的理论基础[16]。
本文通过Western blot、实时荧光定量PCR、病毒产量减少试验来探究boMx1蛋白对CSFV的增殖是否有抑制作用。通过本实验补充了boMx1的抗病毒图谱和增加了抑制CSFV增殖的研究。
1. 实验材料
1.1细胞株与病毒
大肠杆菌DH5α、CSFV石门株、真核表达质粒pcDNA3.0、猪肾细胞PK-15均由本实验室保存。
1.2主要试剂
预染蛋白质分子量标准(Thermo scientific,立陶宛)
PVDF膜(PALL,美国)
脱脂奶粉(内蒙古伊利实业集团股份有限公司,中国)
Mx1单克隆抗体(ab79609,abcam)、WH303鼠源单克隆抗体、GAPDH单克隆抗体(AF0006,Beyotime)、Npro兔源多克隆抗体(由哈尔滨兽医研究所仇华吉老师赠与)、羊抗鼠IgG-HRP、羊抗兔IgG-HRP
增强型ECL化学发光检测试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司,中国)
Trizol Reagent、 PrimeScript® RT Marster Mix (Perfect Real Time) 、SYBR® Premix Ex Taq™ II(大连宝生物生物科技有限公司(TaKaRa),中国)
去内毒素质粒抽提试剂盒(Omega,美国)
Lip3000转染试剂(Life Technology,美国)
DMEM、1640、胎牛血清(GIBCO,美国)
其他试剂均为进口或国产分析纯
1.3主要仪器
ZDX-35BI型自动电热压力蒸汽高压锅,上海申安医疗器械厂,中国
恒温循环水浴锅,重庆科学仪器厂,中国
倒置显微镜、荧光显微镜(Zeiss,德国)
二氧化碳培养箱(Thermo Scientific,美国)
超低温冰箱(SANYO,日本)
垂直电泳系统,湿转印仪(Bio-Rad,美国)
隔水式恒温培养箱(上海索谱仪器有限公司,中国)
生物安全柜(苏州安泰仪器,中国)
实时PCR系统(Applied Biosystems,美国)
自动化学发光成像分析系统,凝胶成像系统(Tanon,中国) 牛Mx1蛋白抑制猪瘟病毒增殖的初步研究 (2):http://www.751com.cn/yixue/lunwen_31517.html
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