毕业论文

打赏
当前位置: 毕业论文 > 生物论文 >

菌落PCR法的阳性重组子筛选(2)

时间:2021-08-03 21:43来源:毕业论文
⑤ 对转化后的细胞进行筛选和鉴定,以便获得外源 DNA 高效稳定表达的基因工程菌或细 胞[1]。 DNA 片段经过连接转化培养后,需筛选平板上的重组质粒菌落

⑤ 对转化后的细胞进行筛选和鉴定,以便获得外源 DNA 高效稳定表达的基因工程菌或细 胞[1]。 

DNA 片段经过连接转化培养后,需筛选平板上的重组质粒菌落,挑出含有插入目的基 因片段的重组阳性克隆。如何快速简便的挑出重组阳性菌落是关键的一步。通常重组子筛 选的方法有:蓝白斑筛选;提取并纯化质粒,依靠酶切或测序等手段检测插入 DNA 是否 正确;PCR 筛选;菌落杂交[2]。这些方法各有优缺点,比如蓝白斑筛选需要载体有特殊的 结构,对于插入的目的基因是小分子 DNA 片段的重组子时,蓝白斑不易鉴别;提取质粒 酶切法当筛选的样品较多时,操作比较繁琐,耗时较长。 

通过菌落 PCR 技术,其特异性依赖与靶细胞两端互补的寡核苷酸引物。PCR 反应由 变性-退火-延伸三个基本反应步骤组成:①模板 DNA 的变性:模板 DNA 经过加热至 95°C 左右一定的时间后,使模板 DNA 双链或经过 PCR 扩增形成的双链 DNA 解离,使之成为 单链 DNA,以便与引物结合;②模板 DNA 与引物的退火(复性):模板 DNA 经过加热变 形成为单链后,温度降至 55°C 左右,引物与模板 DNA 的单链互补配对;③引物的延伸: DNA 模板与引物结合体在 Taq DNA 聚合酶的作用下,以 dNTP 为反应原料、靶序列为模 板,按照碱基互补配对原则,合成一条新的与模板 DNA 互补的半保留复制链,重复循环 变性-退火-延伸三个过程。获得更多的半保留复制链,并为下次循环提供模板,经过 2-3 小时反应就能将待扩的基因扩增到几百万倍。然后通过琼脂糖凝胶电泳与 Marker 大小比对, 筛选出含有目的基因的阳性克隆。 

2 实验试剂和器材 

2.1 实验材料 

灭菌 ddH2O、Taq buffer、dNTP、Taq DNA 聚合酶、DMSO(二甲基亚砜)、TE、正反向引 物、LB 培养基、抗生素、琼脂糖、溴酚蓝、48 孔板、96 孔 PCR 反应板、封口膜、酒精灯、 灭菌 EP 管、灭菌枪头、排枪、镊子、96 孔筛选表、检测胶 

2.2 实验仪器 

表 2-1 实验仪器 

实验仪器名称 规格型号 生产厂家 

梯度 PCR 仪 PTC-225 MJ.Research 

PCR 仪 Thermal Cycler 2720 Applied Biosystems 

电泳仪 DYY-8C 型 北京市六一仪器厂 

生物电泳图像分析系统 仪器

Biosens SC 720B 文献综述

山富科学仪器有限公司 

台式离心机 5415D 德国公司 

电热恒温水槽 DK-8D 型 上海精宏实验设备有限公司 

微量移液器枪 P10,P20,P100,P200, P1000

德国公司 

冰箱 BCD-239VC 新飞 

微波炉 P7021TP 格兰仕集团 

恒温振荡器 WH-861 型 江苏太仓市华美生化仪器 

全温振荡培养箱 HZQ-F280 菌落PCR法的阳性重组子筛选(2):http://www.751com.cn/shengwu/lunwen_79552.html

------分隔线----------------------------
推荐内容