1.1 样品采集

从牛蒡榨菜腌制厂，采取牛蒡腌制初期盐卤样品，装于灭菌玻璃瓶中，置于4℃冰箱保存备用。

1.2 培养基

培养基：酵母膏 5g、蛋白胨 3.75g、柠檬三钠 1.5g、氯化钠 50g、氯化钾 1g、琼脂 10g、硫酸镁（MgSO4·7H2O） 5g、蒸馏水500mL，PH 7.0，,121℃灭菌20min。

1.3 试剂与器材

试剂：PBS（0.1moL/L）、不同浓度的氯化钠溶液、PI染液、溴化乙锭、结晶紫、碘液、乙醇、番红、Loading Buffer、RCR Master Mix、引物27F（RV-M）、引物R1492（MB-47）、ddH2O、细菌基因组DNA快速提取试剂盒（上海捷瑞生物工程有限公司）、SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒（上海生工生物工程）、TAE缓冲液。

器材：DHP-9052型恒温箱、EW-6000微型离心机、TGL-16G台式离心机、HZ-9310K恒温振荡器、UV-7504单光束紫外-可见分光光度计、BDAccuriC6流式细胞仪、TC-25/H型PCR仪、LDZX-50FBS立式压力蒸汽灭菌锅、GelX1520凝胶成像分析系统、DK-S24电热恒温水浴锅、DYY-6C型电泳仪、OLYMPUS显微镜、SW-CJ-2FB净化工作台。

2 试验方法

2.1菌株的培养

2.1.1 菌株的分离纯化

取样品原液100μL，采用逐级梯度稀释方法，将稀释液均匀涂布于含10%NaCl（w/v）的平板上。37℃，培养48h后，标记典型单菌落。挑取单菌落，用平板划线法在含10%NaCl（w/v）的平板上重复多次纯化传代后，挑取单一菌落进行菌体和菌落形态观察。

2.1.2 菌株的保藏

继续纯化传代3次后，配置相同成分培养基斜面，挑取单菌落转接于斜面，恒温培养48h后，置于4℃冰箱保藏、备用。

2.2革兰氏染色及菌体形态观察

用接种环取一滴水于载玻片上，后挑取少量单菌落与水均匀混合，形成薄菌膜。将无菌膜一侧的载玻片在酒精灯火焰的外沿通过两到三次，使细菌死亡并固定在载玻片上。待玻片冷却后，在玻片上滴加草酸铵结晶紫染液，以覆盖菌膜为宜，染色2min，用水小心清洗。滴加碘液，染色2min，水洗。滴加95%的乙醇，脱色30s后，水洗。滴加番红染液，染色3min，水洗。待晾干后镜检。在100*10倍油镜下观察菌体形态。

2.3 细菌基因组提取

挑取嗜盐细菌纯单菌落接入灭菌离心管，放入摇床中37℃，220r/min培养12h。取培养48h菌液，用上海捷瑞生物工程有限公司生产的细菌基因组DNA快速提取试剂盒，提取细菌基因组DNA。

取1mL培养48h后的混合菌液于1.5mL的离心管中，8000rpm，离心1min，弃上清。加入150μL TE悬浮细胞，加入8μL Lysozyme室温下酶解10分钟。向悬液中加入300μL Digestion Solution混匀；加入4μLRNase A混匀，55℃保温10分钟；再加入3μL Proteinase K，55℃保温20分钟源!自`751'文"论(文`网[www.751com.cn。先加入300μL Ext溶液，后加入300μL PB溶液，充分摇动混匀，12000rpm离心5min，溶液分成上下两层，细菌基因组DNA在下层溶液中。用1mL移液枪的枪头伸到下层，将含有DNA基因组的下层溶液全部转移到带有收集管的GenClean柱中。8000rpm离心GenClean柱1min，弃去收集管中的废液。向GenClean柱中加入500μL Wash Solution，8000rpm离心1min，弃去收集管中的废液，重复该操作一次。不向GenClean柱加入任何试剂，12000rpm离心1min，弃去废液。将GenClean柱放入洁净的1.5mL的离心管中，加入40μL提前预热到55℃的Elution Buffer，37℃静置2min，12000rpm离心1min。离心管中液体即细菌DNA组，放置于-20℃冰箱保存。

2.4 电泳检测细菌DNA基因组 牛蒡榨菜腌制初期优势嗜盐细菌耐盐特性研究(3):http://www.751com.cn/shengwu/lunwen_54097.html