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过量铜及甲基紫精对MSR的表达调控研究(3)

时间:2018-09-11 08:42来源:毕业论文
LSLB 培养基:每升培养基含5g 酵母粉,10g 蛋白胨,5gNaCl。固体培养基 每升加 15g 琼脂。调节 PH 值至 7.2。主要用于大肠杆菌的培养。 YEB 培养基:每升培养


    LSLB 培养基:每升培养基含5g 酵母粉,10g 蛋白胨,5gNaCl。固体培养基
每升加 15g 琼脂。调节 PH 值至 7.2。主要用于大肠杆菌的培养。
    YEB 培养基:每升培养基含 10g 酵母粉,10g 蛋白胨,5g 牛肉浸膏。固体
培养基每升加 15g 琼脂。调节 PH 值至 7.0。主要用于农杆菌的培养。
    N6D培养基:每升培养基含3.99g chu N6 Basal Medium,0.1g Myo-inositol,2.878g Proline,0.3g Casamino acid,30g Sucrose,2mg/L 2,4-D,固体培养基每升加15g Gellan gum。调节PH值至5.8。
    2N6-AS培养基:每升培养基含3.99g chu N6 Basal Medium,0.1g Myo-inositol,2.878g Proline,0.3g Casamino acid,30g Sucrose,10g Glucose,2mg/L 2,4-D,固体培养基每升加15g Gellan gum。调节PH值至5.8。
    N6DS培养基:每升培养基含3.99g chu N6 Basal Medium,0.1g Myo-inositol,2.878g Proline,0.3g Casamino acid,30g Sucrose,2mg/L 2,4-D,1mL 100mg/mL cef,1mL 50mg/mL hyg,固体培养基每升加15g Gellan gum。调节PH值至5.8。
    MS-NK培养基:每升培养基含4.43g MS Basal Medium,2g Casamino acid,30g Sucrose,30g Srobitol,0.02mg/L NAA,2mg/L Kinetin,固体培养基每升加15g Gellan gum。调节PH值至5.8。
    MS-HF培养基:每升培养基含4.43g MS Basal Medium,30g Sucrose,固体培养基每升加15g Gellan gum。调节PH值至5.8。
    GUS染色液:每50mL染色液含5mL 1MNaH2PO4,1mL 0.5M Na2EDTA,50μL trionX-100,3.25ml 0.1M K3Fe(CN),3.25ml 0.1M K4Fe(CN),10ml 10mg/ml X-Gulc,ddH2O补齐至50mL。
1.2  试验方法
1.2.1  Cu和MV处理下OsMSRA4.1基因表达量测定
1.2.1.1  Cu和MV处理水稻Dongjin幼苗
    用木村B营养液+8μM/L CuSO4处理水稻Dongjin幼苗三株,并在0、0.5、2、6、12、24、48h时对幼苗取叶片液氮保存。
    用木村B营养液+1μM/L MV处理水稻Dongjin幼苗三株,并在0、0.5、2、6、12、24、48h时对幼苗取叶片液氮保存。
1.2.1.2  测量上述叶片表达量
    选取水稻OsActin-1基因(LOC_Os03g50885)作为稳定的内参基因,在http://rice.plantbiology.msu.edu/上查询OsMSRA4.1(LOC_Os10g41400)的基因编码序列(CDS),使用Primer Premier 5.0设计两者的qPCR引物:
        OsActin-1基因上游引物(Actin1_F):5’-TATGCTCTCCCCCATGCTATC-3’
        OsActin-1基因下游引物(Actin1_R):5’-CCGTTGTGGTGAATGAGTAACC-3’
        OsMSRA4.1基因上游引物 (MSRA4_F):5’-ACCGCCAGGGTAATGATGT-3’
        OsMSRA4.1基因下游引物 (MSRA4_R):5’-CTTCTCCTGCTCAGGGGTG-3’
    每片叶子取0.1g使用RNA提取纯化试剂盒提取RNA并用DNase І消化DNA,使用反转录试剂合成cDNA。使用荧光定量试剂盒,两步法在实时荧光定量PCR仪中进行荧光定量PCR扩增。根据OsMSRA4.1基因和OsActin-1基因相对荧光变化的Ct值,采用2-ΔΔCt法定量分析处理后不同时间OsMSRA4.1基因的表达量。
1.2.2  GUS重组载体的构建
1.2.2.1  引物的设计与合成
    OsMSRA4.1和OsMSRB3基因的定位号分别是LOC_Os10g41400和LOC_Os05g33510,根据定位号从网站 www.rice.plantbiology.msu.edu 获得他们的序列信息。并据此利用 Premier 5.0 生物设计软件设计相应的引物:
        ProA4上游引物(ProA4-F):5' AACAGAAACAGCGGTGATTCTTAG 3'
        ProA4下游引物(ProA4-R):5' CGAGGGAGGCTTTTCCTTTC 3'
        ProB3上游引物(ProB3-F):5' GTGGCGAAGAAGGGATTCAC 3' 过量铜及甲基紫精对MSR的表达调控研究(3):http://www.751com.cn/shengwu/lunwen_22858.html
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