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KCl胁迫条件下嗜盐细菌耐盐特性研究(4)

时间:2021-07-30 20:27来源:毕业论文
2.2.9 嗜盐菌株的培养及其生长曲线测定 将150mL嗜盐菌液体培养基加入三角锥形瓶中,放入条件为37℃、200 rpm的THZ-C恒温振荡器中振荡培养。以空白液体培养

2.2.9 嗜盐菌株的培养及其生长曲线测定

将150mL嗜盐菌液体培养基加入三角锥形瓶中,放入条件为37℃、200 rpm的THZ-C恒温振荡器中振荡培养。以空白液体培养基为对照,使用紫外可见分光光度计每隔2小时检测菌体浓度,检测波长设置为600nm。每次检测都设置3组平行实验,检测结果取平均值,以此绘制出嗜盐菌生长曲线[7]。

2.2.10 不同浓度KCl溶液对嗜盐菌株生长的胁迫影响文献综述

配制不同浓度梯度的KCl溶液(mol/L):0、0.005、0.010、0.015、0.020、0.025、0.030、0.035、0.040、0.045、0.050、0.055、0.060、0.065、0.070、0.075、0.080。

配制碘化丙啶(PI)染液母液:10mg PI溶解于2mL 超纯水中,4℃避光保存。

配制PBS缓冲液(0.1 mol/L)[8]: 

(1)母液A(0.2 mol/L Na2HPO4溶液):称取71.64g Na2HPO4·12H2O,溶解于1000 mL蒸馏水。

(2)母液B(0.2 mol/L NaH2PO4溶液):称取31.21g NaH2PO4·2H2O,溶解于1000 mL蒸馏水。

(3)根据所需的缓冲液pH值将母液A、B按下表2-1中的比例混合,再用蒸馏水稀释至200mL:

表2-1 缓冲液母液A、B混合比例

pH 母液A/mL 母液B/mL

7.0 61.0 39.0

7.1 67.0 33.0

7.2 72.0 28.0

7.3 77.0 23.0

7.4 81.0 19.0

7.5 84.0 16.0

2.2.10.1 预实验:研究嗜盐细菌受KCl溶液胁迫最适的处理时长

配制嗜盐菌液体培养基,培养嗜盐菌。根据嗜盐菌生长曲线,取位于对数生长期的菌体,加入2g/L浓度的KCl溶液,分别胁迫不同的时长:0.5小时、1.0小时、1.5小时、2.0小时、2.5小时、3.0小时。胁迫完成后,6000 rpm离心3分钟,弃去KCl溶液,保留菌体,加入等体积的PBS缓冲液洗脱。重复以上离心洗脱步骤两次。再加入PBS缓冲液制成菌体悬液,利用血球计数板计数,计算出菌体悬液中的总菌数值。适当稀释菌体悬液,适宜流式细胞仪检测的样品浓度为106-107个/mL。吸取500μL 稀释悬液,加入1μL PI染液母液,避光染色25分钟后,用滤膜过滤除杂。以未经KCl溶液胁迫并未染色的菌体为阴性对照,以未经KCl溶液胁迫并染色的菌体为阳性对照,进行上样检测。将样品放入流式细胞仪,通过 660/16 nm带通滤片(FL3)检测荧光强度信号,以FL3-H表示,最后得到FCM图谱[9]。来!自~751论-文|网www.751com.cn

2.2.10.2 研究不同浓度梯度的KCl溶液对嗜盐细菌生长的胁迫影响

   配制嗜盐菌液体培养基,培养嗜盐菌。根据嗜盐菌生长曲线,取位于对数生长期的菌体,分别加入不同浓度梯度的KCl溶液,以预实验研究得到的适宜时长进行胁迫处理。胁迫完成后,具体的离心洗脱步骤同上。之后加入PBS缓冲液制成菌体悬液,适当稀释以达到适宜的上样浓度。在500μL 稀释悬液中加入1μL PI染液母液,避光染色25分钟后,过滤除杂。以未经KCl溶液胁迫并未染色的菌体为阴性对照,以未经KCl溶液胁迫并染色的菌体为阳性对照,进行上样检测。步骤同上。

KCl胁迫条件下嗜盐细菌耐盐特性研究(4):http://www.751com.cn/shengwu/lunwen_79020.html
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