目前，药剂防治是控制黄瓜枯萎病的重要方法，但是由于缺乏高效、低毒、无污染的杀菌剂，故易造成农药的残留，危害人们身体健康[3]。另外，由于黄瓜枯萎病属于土传病害，难以实行大面积的土壤药剂处理，所以成本较高[4]。随着现代社会的发展，人们对无公害食品的强烈需求和环境保护的日益注重，生物防治引起了人们的高度重视[5]。

   近年来，涉及黄瓜枯萎病生物防治的研究越来越多，并取得较大的进展，新开发出很多生防因子和生防制剂，各种生防因子的交互使用，使得黄瓜枯萎病的生物防治手段呈多样化发展，更便于人们因地和因时制宜的选择合理有效的防治方法[6]。简单来说，生物防治主要是利用拮抗微生物以及其代谢产物来达到防治植物病害的目的。筛选高效的拮抗微生物是生物防治的前提与关键。

黄瓜枯萎病是黄瓜生产中重要病害，严重影响黄瓜产量与品质，瓜菇轮作模式作为本地区特色农业种植方式，在该模式中，黄瓜枯萎病发病率显著降低。本研究以该模式作为研究对象，拟从菇渣处理后的黄瓜根围土中分离能够防治黄瓜枯萎病的生物防治菌株并且进行初步评价。首先通过离体条件下产酶活性筛选具有生防潜力的菌株，然后进行温室实验评价。旨在寻找一条适合本地区特色栽培方式的黄瓜枯萎病防治方法。

2.材料与方法

2.1菌株分离

从江苏省淮安市淮阴区丁集黄瓜大棚里采集根际土壤，用自封袋封好后带回实验室，然后称取根围土3 g, 分别加入到 27 mL 灭菌水中（含灭菌玻璃珠），180 rmp 摇床振荡 0.5 h，静置 5 min，得到10-1 稀释液，吸取上清液 0.1 mL 依次稀释，分别取 10-4---10-6 三个梯度 0.1 mL 涂 LB 平板，28°C 培养 48 h,选取菌落数在 50---300 之间的平板，计数并且挑取所有菌落，纯化，-70℃，40 % 甘油保存备用[9]。共纯化菌株172株待实验，标记为T1-1~T1-28；T2-1~T2-16；T3-1~T3-12及T3-30；C1-1~C1-52；C2-1~C2-25；C3-1~C3-39。文献综述

2.2培养基与试剂

LB培养基(1L)：氯化钠 10 g，胰蛋白胨 10g，酵母提取物 5g，琼脂 20g。PH值调至7.2。PDA培养基（1L）：去皮马铃薯200.0g，葡萄糖（或蔗糖）20.0g，琼脂15-20g。自然pH。制法：马铃薯去皮后，切成小块，加水煮烂（煮沸20-30分钟，能被玻璃棒戳破即可），用4层纱布过滤，再加糖和琼脂，加热融化后再补足水分至1000ml，121℃下灭菌20分钟左右。

2.3产酶和代谢产物活性测定

2.3.1几丁质酶活性检测

 将细菌在以几丁质为唯一碳源的培养基（Chi-Ayers）：（NH4H2PO4 1.0g,KCl 0.2g, MgSO4·7H2O 0.2g，胶体状几丁质1%（w/v），定容至1000ml，pH=7.0，琼脂20g）上培养，接菌后30℃培养3天，测透明圈的内径和外径。

  胶体状几丁质的制备：20 g 甲壳素溶于 350 mL 浓盐酸，4 ℃放置 24 h，玻璃棉过滤，滤液加入 2 L 冰无水乙醇(－20 ℃过夜)，10000 g离心20 min，沉淀用自来水冲洗，直至 pH 为中性，冷冻干燥，－20 ℃密封保存。使用时，胶体状几丁质必须用手动匀浆器至少研磨 5 次 [10]。

2.3.2产嗜铁素活性检测

测定嗜铁素是否产生，参照 Shin 等人[11]的方法。A：1，60.5 mg CAS (铬天青S) 溶于 50 mL 去离子水；2，10 mL三价铁溶液(1 mM FeCl3.6H2O，10 mM 盐酸为溶剂)；3，72.9 mg HDTMA 溶于 40 mL去离子水。上述三个溶液混合定容至 100 mL，pH调至中性，121℃灭菌 20 min。B：30.24 g Pipes加入 900 mL Waker agar培养基，12 g 50% (W/V) 的 NaOH 溶液将培养基 pH 调至 6.8，121℃灭菌 20 min。A，B液混合倒平板，接菌 30℃ 培养 3 天观察并且测量透明圈内径和外径。来!自~751论-文|网www.751com.cn 瓜菇轮作模式中黄瓜枯萎病生防菌株的筛选与评价(2):http://www.751com.cn/shengwu/lunwen_76325.html