本课题研究的重组克鲁维酵母是通过基因工程的技术，人工合成里氏木霉的外切葡聚糖酶基因，导入马克斯克鲁维酵母中, 利用酵母生长快、蛋白分泌能力强、易于培养等特点[6]，使外切葡聚糖酶基因能够在常温和短时间内快速、超量表达，达到降低能耗和提高经济效益的目的。

2  实验材料

2.1  菌种

成功表达里氏木霉基因的马克斯克鲁维酵母重组菌株。

2.2  培养基与试剂

YPG液体培养基：酵母粉10 g /L，蛋白胨20 g /L，α-乳糖 20 g /L。

柠檬酸缓冲液：柠檬酸 210g/L，调节pH至3.8，然后按1：19比例稀释至pH值为4.8。

2.3  主要仪器与设备

2S-75HJ型高压灭菌锅：江阴滨江医疗设备有限公司

HH-S恒温水浴锅：金坛市亿通电子有限公司

EPED-E2-10TF纯水仪：南京易普易达科技发展有限公司

SW-CJ-IFD型单人单面净化工作台：苏州净化设备有限公司

SPX-250B生化培养箱：上海佳胜实验设备有限公司

电子天平BS210S：北京赛多利斯天平有限公司

高速冷冻离心机HR21M：湖南赫西仪器设备有限公司

HD-930DHG-9240A型电热恒温鼓风干燥箱：上海精宏实验设备有限公司

ZF1-Ⅰ多功能紫外分析仪：上海汗诺仪器有限公司

HD-930型组合式全温摇床：太仓市博莱特实验仪器厂

3  实验方法

3.1  初始pH值优化

YPG培养基的pH值默认为6.8，而里氏木霉的最适pH值一般在4.0 到6.0之间，在pH为 8.0时酶活力可能受到影响。有报道指出里氏木霉表达系统在不同的初始pH值下表达不同的外源蛋白差异显著。因此我们调整YPG培养基的初始pH值分别为3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，分别测定上清酶活，以确定最适初始pH值。

3.2  培养基碳源优化

我们观察到YPG培养基中的α-乳糖浓度对重组马克斯克鲁维酵母向培养液中分泌的重组酶活力和蛋白产量影响很大，因此我们在YPG培养基中尝试使用不同的α-乳糖浓度，10，15，20，25和30 g/L，接种培养后分别测定上清酶活，以确定最适的α-乳糖浓度以及对重组细胞生长的影响。

3.3  培养基氮源优化

基于同样的原因，我们对YPG培养基中的氮源乙酰胺的浓度进行了优化，分别加入16、18、20、22、24和26 g/L 乙酰氨，测定上清的马克斯克鲁维酵母酶活，以确定最佳的乙酰胺浓度以及它对重组细胞生长的影响。

3.4  生物素浓度优化

研究表明添加生物素能够促进细胞的生长，对于加入生物素浓度的控制也会影响到重组马克斯克鲁维酵母的产酶，因此我们尝试在培养基中添加不同浓度的生物素，50，100，150，200，250和300 mg/ml,接种后测上清确定最适浓度。来.自/751论|文-网www.751com.cn/

3.5  重组菌酶活测定

将待测酶液稀释到合适浓度后，向每只试管（底物空白除外）中加入0.5ml经稀释过

酶液，加入1mL的柠檬酸缓冲溶液(0.05 M、 pH 4.8)，底物空白也加入1.5ml的柠檬酸缓冲溶液。向每支试管中加入1cmⅹ6cm的长方形重量约为50mg的滤纸条，底物空白也加入滤纸条。将每只试管放入50℃的水浴锅中预热2-3min，将滤纸逐一戳入试管底部，充分浸浴在液体下，同时计时1h。待反应1h后迅速加入3ml的DNS以终止上述酶反应，充分摇匀后沸水浴5min，快速冷却。取1mL的反应液加水适当稀释后，以底物空白为空白在540nm的波长下测定吸光值。