液体YPD培养基：葡萄糖20.0 g/l，酵母粉10.0 g/l，蛋白胨20.0 g/l，在115 ºC，灭菌30 min。

发酵培养基：葡萄糖 40.0 g/l（对照），(NH4)2SO4 0.25 g/l，KH2PO4 1.7 g/l，Na2HPO4 12.0 g/l，MgSO4·7H2O 1.25 g/l，酵母提取物0.25 g/l（对照）或玉米浆，硫胺素 0.006 g/l，蒸馏水 1.0 l。培养基配好后用浓盐酸调pH至6.0，115 ºC高温高压灭菌30 min，1.6% (w/v) 溴甲酚紫指示剂过滤除菌后，以100.0 l/50.0 ml培养基的剂量加入冷却的发酵培养基（当培养基中加入CaCO3时，无需再加指示剂）。文献综述

2.1.4 试剂

1.6% (w/v) 溴甲酚紫指示剂：称取1.6 g溴甲酚紫溶于100.0 ml 95.0% (v/v) 乙醇中，充分溶解。

2.0 M KOH溶液：称取11.2 g KOH溶于100.0 ml蒸馏水中，高温高压灭菌冷却待用。

柠檬酸测定试剂：

10.0% (w/v) HPO3：5.0 g HPO3充分溶于50.0 ml 9.0 M H2SO4中。

KMnO4-NaBr溶液：称取5.0 g KMnO4溶于80.0 ml蒸馏水中，再称量5.0 g NaBr溶于上述KMnO4溶液中，最后将溶液定容至100.0 ml。

3.0% (v/v) H2O2溶液：量取10.0 ml 30.0% (v/v) 的H2O2溶液，用蒸馏水定容至100.0 ml。

硼酸钠-硫脲试剂：准确称取4.0 g硫脲溶于蒸馏水中，并定容至100.0 ml。再准确称取2.0 g硼酸钠溶于上述硫脲溶液中，最后用硫脲溶液定容至100.0ml。

以上所用试剂均为分析纯

2.2 方法 

2.2.1 种子液培养

保种管内的菌种划线至YPD固体培养基，在28 ºC下恒温静置活化培养2~3天。挑取单菌落接种于液体YPD中，在28 ºC和180 rpm下振荡培养至菌体浓度达到OD600 nm=30.0左右。

2.2.2 发酵培养

柠檬酸发酵在发酵培养基中进行，发酵培养基中分别加入不同浓度的玉米浆，葡萄糖和CaCO3。对照组培养基分别以酵母提取物为氮源0.25 g/l，葡萄糖40.0 g/l，不加碳酸钙（以2.0 M KOH调pH）。

取1.0 ml（OD600 nm=30）种子液接种到50.0ml发酵培养基中，在28℃，180rpm下振荡培养。对照组培养过程中加入溴甲酚紫100 ml（1.6%）作为指示剂，以2.0 M KOH调节培养基pH，使发酵pH保持在6.0左右。

以优化后的发酵条件在5-l的发酵罐中扩大培养。发酵罐配置有碱泵，氧传感器，搅拌器，加热元件和温度传感器等元件。种子培养液准备如上述方法进行。取60.0ml的种子培养液（OD600nm=30.0）转移到1.5 l含有葡萄糖60.0 g/l, 玉米浆1.0 g/l, CaCO3 40.0 g/l的培养基中。在搅拌速度为250 rpm，通气速率为3.0 l/min/l，温度为28℃的条件下进行发酵培养，发酵时间288 h，培养期间每隔24 h收集20.0 ml培养物进行产物含量测定。源.自/751·论\文'网·www.751com.cn/

2.3 产物产量测定

柠檬酸含量则通过Camp 和Farmer报道的方法进行测定[10]。具体方法如下：

1）1.0 ml培养液于5000 × g离心5.0 min，取上清液稀释100倍后用于测定。

2）取1.0 ml稀释液于试管中，加1.0 ml HPO3（10%）冰浴。

3）取2.0 ml KMnO4-NaBr溶液加至上述试管中，冰浴10 min。

4）向试管中滴加3.0% H2O2，使管内溶液褪至无色。

5）取1.5 ml正庚烷加入试管中，充分振荡1分钟。静置分层后取1.0 ml上层有机相转至另一试管中。

6）在上步所取的1.0 ml有机相中加入3.5 ml硼酸钠-硫脲试剂，充分混匀1 min，静置10 min后 取3.0 ml下层溶液，445 nm测吸光值并通过标准曲线计算发酵液柠檬酸含量。重复测定3次取平均值。

空白对照：1.0 ml正庚烷 + 3.5 ml硼酸钠-硫脲试剂涡旋，取下层液体作为样品测定的空白对照。